1月11日，国际学术期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）在线发表了中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所赵国屏研究组题为The CCTL (Cpf1-assisted Cutting and Taq DNA ligase-assisted Ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro 的研究论文。该工作鉴定了Cpf1蛋白的精确切割位点，并基于该切割特性开发新的DNA无缝拼接方法。

　　CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是存在于原核生物中的获得性免疫系统，CRISPR相关蛋白Cas9已广泛应用于基因组编辑和许多其他应用当中。Cpf1蛋白隶属于II类type V CRISPR系统。相比于Cas9蛋白，Cpf1蛋白具有类似的基因组编辑效率，但具有较低的脱靶效应，在基因治疗应用中具有巨大的潜力。不同于Cas9，Cpf1由单个crRNA指导，并利用富含T的protospacer相邻基序（PAM）序列切割双链DNA（dsDNA）靶标，形成5-nt粘性末端。Cpf1的切割特性使得其成为有效的体外DNA拼接工具，并且最近的研究中报道了基于Cpf1消化和T4DNA连接酶介导的连接建立的DNA拼接标准C-Brick。

　　在该研究中，研究人员发现，Cpf1切割靶标DNA并不像之前报道的那样，只切割靶标DNA互补链的23位和非互补链的18位，而是在非互补链的14位到18位形成多个切割位点。除此之外，该文研究人员还发现Cpf1的切割位点受到crRNA spacer序列长度的影响。当spacer序列长度大于等于20的时候，Cpf1倾向于切割非互补链的18位，而当spacer序列长度小于20的时候，Cpf1倾向于切割非互补链的14位。基于Cpf1在较短spacer长度的crRNA介导下，可以特异切割靶标DNA的14位与22位，形成8－nt的长黏性末端的特性，结合Taq DNA连接酶高精度的连接特性，研究人员将其开发为一个大DNA片段体外无缝编辑的新工具。在应用实例中，研究人员成功将30kb的放线紫红素合成基因簇内部调控基因actII-orf4 的启动子进行了原位的替换。经过反应条件的优化，替换的阳性率达到70%以上。该方法为大片段体外编辑提供了一个高效工具。

上海生科院在Cpf1蛋白切割机理方面取得新进展